蜂王漿中活性組分的研究
蜂王漿是由工蜂咽下腺和上顎腺分泌的,專供蜜蜂小幼蟲和蜂王食用的漿狀物。越來越多的研究表明,蜂王漿是一種非常適宜人類保健的天然食品,大量的動物試驗和人體試食實驗證明其具有多種醫(yī)療保健功能,對特定的活性組分進行分離純化,驗證蜂王漿所含有的活性組分。蜂王漿活性組分的研究己不僅僅停留在10-經基-癸烯酸層面,其活性蛋白和多膚已成為關注的焦點。
1 免疫調節(jié)活性組分
大量動物試驗證明,蜂王漿具有免疫調節(jié)功能。Lidija(1996)報道王漿可作為大鼠和小白鼠的一種潛在的免疫調節(jié)劑,具有刺激小白鼠抗體產量增加和免疫活性細胞增生、抑制大鼠體液免疫作用的免疫調節(jié)功能。Kaboka(2001)報道王漿抗過敏作用機理分析,表明其抗過敏作用機制與紫蘇葉子提取物(PFE)作用不同。Hideki(2001)報道王漿抗過敏反應與巨噬細胞的修復功能和Th1/Th2反應提高有關。
Yoshifumi(2003)報道口服王漿對NC/Nga小鼠特異性皮炎損傷的抑制作用,證明服用王漿可抑制卵清蛋白/明礬免疫刺激小鼠脾細胞產生IL-4、IL-5、IL-10、抗原特性干擾素-(IFN-)的產量。
Iwao(2003)報道王漿主蛋白之廣MRJP3在體內和體外的調節(jié)免疫反應。他們根據(jù)降低OVA/alum 刺激老鼠衍生的脾細胞產生的IL-4產量篩選出王漿中的抗過敏因子,采用一系列柱層析,純化到一個70kDa糖蛋白MRJP3,MRJP3降低IL-4產量。在體內(in vitro)試驗中,MRJP3不僅降低IL-4產量還通過抑制T細胞增生而降低IL-2和IFN-產量。令人感興趣的是。盡管MRJP3本身作為外來蛋白具有抗原性,但在免疫反應小鼠腹膜內注射MBJP3能抑制血清抗OVA-IgE和IgG1水平,此外,加熱后可溶的MRJP3處理降低它的抗原性而保持對OVA抗體反應的抑制作用。這些結果表明,MBJP3在體內和體外具有免疫調節(jié)功能。
2 抗腫瘤因子10-HDA
Townsend(1959)報道蜂王漿具有抑制小鼠白血病和腹水癌的作用,而且這種腫瘤抑制作用與王漿中的10-HDA有關。Tamura(1987)采用小白鼠白血病L1210、P388系和艾氏肉瘤腹水180移植,檢測蜂王漿的抗腫瘤作用。設計預防治療(在腫瘤移植之前30天和移植之后30天)或治療(在腫瘤移植之后30天)兩種試驗方法,腫瘤細胞以腹水方式被移植。日服用王漿量為0(對照)、10、100、1000mg/kg。在移植白血病L1210、P388治療試驗中,老鼠只活了8~9天,王漿沒有表現(xiàn)任何的抗腫瘤作用。在移植S-180腹水腫瘤試驗中,表現(xiàn)出中等存活時間16天,延長壽命9.3天約19.3%在移植艾氏腹水腫瘤試驗中(存活時間為22.1天),延長壽命204%(每天服用王漿10mg/kg)和17.6%(每天服用王漿1000mg/kg),但在每天服用王漿100mb/kg試驗組中沒有表現(xiàn)出抗腫瘤作用。王漿還能對化療和放療患者起保護作用(Bariliak 1996)。
3 促細胞生長因子57-kDa蛋白
Watanabe(1996)證明蜂王漿中的DIII蛋白具有促進淋巴細胞系生長的作用。Kazuhiko(1998)采用離子交換層析對王漿進行分離,獲得一個能促進人骨髓細胞系U-937生長的蛋白(DIII),SDS-PAGE證明DIII的分子量為57kDa,DIII蛋白的生長刺激活力對熱和pH表現(xiàn)穩(wěn)定。
Kamakurra(2001b)對原代培養(yǎng)的大鼠肝細胞的生理影響進行研究,發(fā)現(xiàn)57-kDa蛋白能顯著刺激肝細胞的DNA合成,而牛血清白蛋白和40℃下貯存7天的王漿(喪失57-kDa蛋白)則無此功能,用胰蛋白酶處理57-kDa蛋白,其促**活性也完全喪失,同時57-kDa蛋白的促**活力具有劑量效應,濃度越高活力越強,這些結果證明王漿中的57-kDa蛋白是一個促細胞**因子。
4 抗氧化活性蛋白
Takeshi(2001)研究了一些商品蜂蜜、王漿、蜂膠的抗氧化活力。采用脂質過氧化模型評價蜂蜜、王漿、蜂膠的抗氧化能力。發(fā)現(xiàn)抗氧化作用隨時間的延長活力逐漸下降。Takeshi and Reiji(2004)從新鮮的中國產王漿中制備水提成分(WSR)和堿提成分(ASR),產量分別是干物質的8.3%和6.3%。通過SDS-PAGE分析,兩種提取成分的蛋白條帶十分相似,但不完全相同。兩種提取成分的抗氧化活力隨濃度的增高而增強,兩種提取物對超氧自由基的清
除能力很高,濃度為100mg/mL的活力與5mM維生素C的活力相同,雖然WSR和ASR在濃度50mg/mL、100mg/mL時的活力不如1mM維生素E的活力,但能清除樣品中約50%~60%的經基自由基。這表明王漿中的蛋白成分有強的抗氧化能力和清除活性氧的能力,王漿可用于抗氧化健康食品和藥品。
5 抗疲勞因子57-kDa蛋白
Kamakura(2001)報道鮮王漿對小鼠的抗疲勞作用。他們檢測鮮王漿(采收后立即放在-20℃下貯藏)對雄性小鼠的抗疲勞作用。小鼠被訓練成慣于在可調水流的游泳池內游泳,然后在2周內被強制游5次,測出游到力竭時的總游泳時間,再把它們分成游泳能力相同的3個組,這3個組在游泳前分別飼喂王漿、貯存40℃ 7天的王漿(40~7d RJ)和包含酪蛋白、玉米淀粉、大豆油對照溶液。所有小鼠被強制游15分鐘一次,休息一段時間后檢測耐疲勞最長游泳時間,鮮王漿組與其他組相比游泳時間顯著延長;王漿組小鼠的游泳后血清乳酸、氨聚集顯著減少,肌肉糖原喪失顯著減少;而40~7d RJ小鼠與對照組相比這些指標差異不顯著。對王漿的組分進行數(shù)量分析表明57-kDa蛋白在40℃貯存7天后顯著降解,而各種維生素、10-HDA、其他脂肪酸沒有改變。這些發(fā)現(xiàn)說明,王漿在小鼠運動后能改善生理疲勞,王漿對小鼠的抗疲勞作用與王漿的新鮮度即57-kDa蛋白含量有關。
6 抗高血壓小肽
最新研究表明,蜂王漿蛋白經酶解可獲得抗高血壓的多種小膚。Toshiro(2002)報道完全王漿和它的分離蛋白根本不會阻礙血管緊張肽I-轉化酶(ACE)的活力,然而,王漿經胃蛋白酶水解、隨后的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解產物具有抑制血管緊張肽的能力。采用凝膠滲透層析對王漿水解產物進行分離,獲得二肽、三肽片段,其中有8個肽是首次從自然資源中鑒定出來。因此,王漿蛋白被認為是一種可通過胃腸酶水解獲取ACE抑制肽的好資源。
Katsu(2004)報道經蛋白酶處理的王漿(ProRJ)和從中獲得的多膚具有抑制血管緊張膚I—轉化酶活性,給自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)口服ProRJ或多肽有抗高血壓作用。因此,服用王漿蛋白酶解多肽可作為一種功能食品,有利于改善高血壓患者的血壓。
7 降脂因子10-HDA和-羥基酸
Kitaharaa(1995)研究發(fā)現(xiàn)王漿中的-q羥基酸對皮脂腺脂肪合成的抑制作用。10-羥基-2-癸烯酸(10-HDA王漿酸)已被證明具有抑制脂肪合成的作用,在這個研究中,他們檢測了王漿中的其他脂質對脂肪合成的影響,發(fā)現(xiàn)一系列-經基酸比王漿酸能更有效抑制標記乙酸結合到倉鼠耳朵皮脂腺。而且,當局部用到雄性倉鼠耳朵,10-經基-癸烯酸和11-經基-十一烯酸抑制皮脂腺脂肪生成。這些發(fā)現(xiàn)說明除王漿酸外,王漿中的其他類型的-經基酸對脂肪合成也有抑制作用。
8 調節(jié)血糖的胰島素樣多肽
Karl(1977)報道蜜蜂王漿中胰島素樣物質降血糖作用和免疫活力。西方蜜蜂王漿的水提物注射到角質化螟蟲(Manduca **ta)幼蟲時產生了低血糖,應用特異性放射免疫檢測部分純化的提取物,表明王漿包含幾個胰島素樣多肽,其中主要免疫反應組分的分子量明顯與牛的胰島素相似。這些結果說明蜜蜂中存在的一個多肽與脊椎動物的胰島素具有生物學和結構上的相似性。Karl(1982)報道昆蟲血淋巴和王漿中胰島素的純化。西方蜜蜂王漿中胰島素樣多肽通過酸提、離子交換層析、凝膠過濾和親和層析得以純化。從每克王漿中檢測出25pg豬胰島素當量。西方蜜蜂的胰島素樣多膚的溶解度、層析、免疫和生物學特性與脊椎動物胰島素相似,這些結果說明蜜蜂胰島素與脊椎動物胰島素結構相似。Kevin(1985)發(fā)現(xiàn)蜜蜂個體和它的頭部提取物在豬胰島素放射免疫檢測中發(fā)生雜交反應,而其去掉頭部的軀體則缺乏活力,這表明合成類胰島素的部位在頭部,可能在王漿合成器官—咽下腺。
9 抗菌多肽
蜂王漿的抗菌作用與10-HDA有關,更多的研究表明,蜂王漿中還含有豐富的抗菌多肽。Fujiwara(1990)報道王漿中一種潛在的抗菌蛋白royalisin。通過酸提取從王漿中分離獲得這種蛋白,分子量估計為5523 Da,其一級結構由51個氨基酸殘基組成,有3個分子內二硫鍵。在生物檢測中,royalisin在低濃度下具有抑制革蘭氏陽性細菌的潛力,但對革蘭氏陰性菌不起作用。Sauerwald(1998)研究結果證明王漿中的水溶成分如多肽、蛋白對抗細菌和抗真菌作用也很重要。Bilikova(2001)報道在酸性條件下采用二重透析分離王漿中的多膚成分,采用不同孔徑的膜對王漿進行透析,其中的多肽成分對蜜蜂的病原菌——引起美幼病的幼蟲芽胞桿菌具有抑制作用,對其他革蘭氏陽性菌如枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)和八疊球菌(Sarcina lutea) 也有抑制作用,而對大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Serratia marcescens)無抑制作用。此外,多肽成分對模型真菌灰霉(Botrytis cinerea)也有抑制作用。
隨著蜂王漿高產蜂王為主體的高產配套技術的不斷推廣和提高,蜂王漿已成為一種重要的可再生生物資源,蜂王漿原料價格偏低,蜂王漿深加工已成為可能和必要。在國家自然科學基金和科技部創(chuàng)新基金的資助下,我們先后克隆了蜂王漿MRJPl、MBJP2、MRJP3、MBJP5等活性蛋白的全長cDNA序列;并采用以膜分離和酶工程為主體的先進技術,分離制備蜂王漿中的活性組分,獲國家發(fā)明專利一項(專利號:zL-03150404.3)。我們愿與蜂業(yè)同行一道,共同開發(fā)利用我國特有的蜂王漿資源,做大做強蜂王漿產業(yè)。
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