蜂蜜中氯霉素殘留量檢測方法研究概況
摘要：綜述了近幾年來國內外蜂蜜中氯霉素殘留檢測方法。著重介紹了高效液相色譜法、毛細管電泳法、酶聯免疫法、色/質聯用分析法以及生物傳感器法，并分別綜述了各種方法的優勢與不足，最后展望了蜂蜜中氯霉素殘留檢測的發展趨勢。
關鍵詞：蜂蜜；氯霉素；殘留；高效液相色譜法；毛細管電泳法；酶聯免疫法；色／質聯用分析法；生物傳感器法
近年來，國內外發展起來的蜂蜜中氯霉素殘留量檢測方法有液相色譜法、毛細管電泳法、免疫分析法、色譜／質譜聯用法等。現對這些檢測方法作一介紹。
1 高效液相色譜法
高效液相色譜法HPLC是將一定極性的單一或混合溶劑作為流動相，用泵將流動相注入裝有填充劑的色譜柱內，注入的供試品被流動相帶入柱內進行分離，各成分先后進入檢測器，用記錄儀或數據處理裝置記錄色譜圖和進行數據處理，得出測定結果。
1982年 Juergens U 使用HPLC分析蜂蜜中氯霉素和磺胺噻唑殘留。1994年胡大晰等應用HPLC定量分析出口蜂蜜中氯霉素殘留量，樣品用去離子水溶解后，經1-X8吸附樹脂柱凈化和富集，在Waters C18柱上分離，紫外測定。檢測限為0.01 μg/g，回收率為86.37％～101.5%。
日本2002年對進出口蜂蜜中氯霉素的檢測是先把蜂蜜中氯霉素用0asis HLB固相萃取小柱精制后，用乙酸乙酯提取，硅膠柱精制，再用HPLC和紫外檢測器進行測定，檢測限為0.10 mg/kg。2005年Moise.A等也是采用HPLC對來自羅馬尼亞不同地區的10個蜂蜜樣品中氯霉素進行殘留分析。
HPLC雖然分離效率高，速度快，但儀器昂貴，樣品需要前處理，操作人員需要進行嚴格的培訓，并且最低檢測限較高，無法滿足當前對氯霉素低殘留量的檢測要求。 2 毛細管電泳法
毛細管電泳法也稱為高效毛細管電泳法，是近幾年來迅速發展起來的一種分離分析技術，是在毛細管中利用帶電組分在高電場中遷移率不同而進行分離的，其顯著特點是高效、快速和微量。
2001年，陳天豹等用此法結合二級管陣列紫外檢測器對蜂蜜中殘留的氯霉素進行定量分析，氯霉素的檢測限為10 μg/L，回收率大于89.6％。
此法雖然不需要復雜的抽提和凈化程序，具有簡單、柱效高、分離速度快、樣品用量少、分析成本低等優點，但最低檢測限仍然較高，無法滿足當前對氯霉素低殘留量的檢測要求。
3 酶聯免疫分析法
氯霉素定量酶聯免疫檢測法是利用抗體與抗原間免疫化學反應，酶標氯霉素結合體與樣品檢體中氯霉素殘留物同時競爭固定在酶標子L的氯霉素抗體，待檢體中氯霉素的含量愈高，顯色反應愈淺，待檢體中氯霉素的含量愈低，顯色反應愈深。再加入終止液，用酶標儀測標準品和樣品檢體吸光值，吸光值與樣品檢體中氯霉素濃度成反比。
2004年劉堃等采用辣根過氧化物酶與氯霉素結合作為酶標氯霉素進行反應，其檢測靈敏度為0.3 μg／kg。隨著研究工作的深入發展已有測定氯霉素的試劑盒投放市場，但蔣宏偉等使用荷蘭生產的EUSA試劑盒進行監測，氯霉素的檢測限為0.02 ng/g。
HAO Yu Shen 等采用的是由r-Biopharm公司提供的試劑盒，檢出限為0.30 μg/kg。而G.ScoKichini 等用由Euro-Diapostica B.V 提供的試劑盒進行EUSA定性篩選，蜂蜜的檢測力小于0.30 μg/kg。
酶聯免疫法具有簡單、快速、處理樣品量大、靈敏度較高、特異性強等諸多優點，適合于現場篩選。但ELISA中可發生多種非特異吸附作用，其主要的非特異反應是由于抗體反應體系選擇不當所致，不合適的抗體反應體系引起的非特異反應可導致EHSA出現假附性結果，并且只作為陰性確認，其結果若為附性，還需用GC／MS進一步確認。
4 色／質聯用分析法
4.1 氣相色譜—質譜聯用法
氣相色譜是一種公認的快速、高效的分離技術，特別適合于復雜混合物的分離。由于它只是利用保留時間作為鑒定手段，要對分離出來的每個組分做出明確鑒定是困難的。而質譜法是一種重要的定性鑒定和結構分析方法，對復雜的有機化合物具有很高的鑒別能力，是一種高靈敏度、高效的定性分析工具，它與許多用于定性分析儀器一樣，沒有分離能力，不能直接分析化合物。二者結合起來，將色譜儀作為質譜儀的進樣和分析系統，把質譜儀作為色譜儀的檢測器，將充分發揮色譜和質譜各自的優點。
迂君、劉宜孜等都報道了先經固相萃取后再采用GC—MS測定蜂蜜中的氯霉素殘留量，并且所選用的離子源都是化學電離源(CI)。其中迂君等所選用的是正化學電離源，其檢出限僅為20 ng/mL，而劉宜孜、王建華、陳朝方均選用的是負化學電離源(NCl)，得到的相應檢出限分別為0.1 μg/kg，0.1 μg/kg，0.5 μg/kg。
HAo Yu Shen 等分別采用氣相色譜—質譜—電子轟擊離子源—選擇離子監控器(GC-MS-EI-SIM)，氣相色譜質譜—負化學電離源—選擇離子監控器(GCMS-NCI-SIM)對包括海洋食品、肉類、蜂蜜等10種基質中的氯霉素進行篩選檢測，兩種分析方法所得到的檢出限分別為1.0 μg/kg和0.1 μg/kg，添加濃度下，回收率均為75％～120％。
對于氯霉素來說，負離子的CI質譜圖靈敏度要比其正離子的CI質譜圖高2～3個數量級，所以質譜儀選用NCI的靈敏度更高，干擾更少。本法結合了氣相色譜分離特性強和質譜儀良好的定性能力，使分離、定量和定性同時進行。但是它的局限性在于只適合于分析可以氣化的樣品。
4.2 液相色譜—質譜聯用
高效液相色譜(HPLC)具有高分離能力和高分析速度等優點，是復雜混合物分離的主要手段。但是，由于HPLC本身在進行定性分析時的主要依據是保留值，缺乏有用的結構信息，因而它很難以對復雜未知混合物進行定性分析。相反，質譜(MS)具有很強的結構鑒定能力，但卻不具備分離能力，因而不能直接用于復雜混合物的鑒定。把HPLC和MS有機結合起來的聯用技術，由于結合了兩者的長處，是復雜化合物分析的有效手段。在HPLc-Ms聯用系統中，HPLc相當于譜學方法的分離和進樣裝置，Ms則相當于色譜儀的檢測器。在此基礎上還發展了串聯質譜(Ms-Ms)，該法具有快速，高靈敏度和高專一性等特點，不受化學噪聲的干擾。
2003年 L.verzegnassi 等用液相色譜—電噴霧串聯質譜法分析了來自阿根廷、澳大利亞、古巴、中國的蜂蜜中氯霉素殘留量，檢出限和檢測力都低于0.1 μg/kg。
2004年 A.F.Forti 等先將蜂蜜溶解于水，用二氯甲烷與丙酮的混合物進行萃取，以C18柱凈化，采用電噴霧電離負離子模式，用LC-MS／MS檢測，檢出限為0.07 μg/kg，回收率為98.7％～102.0％。
2005年 Kannan.V 等用此法對商品蜜中氯霉素殘留量進行檢測，檢出限為0.05 ng/g。Anton.K F等用高效液相色譜和質譜檢測器相結合的方法檢測蜂蜜中氯霉素，但由于其采用了sub-2 μm particulate高效液相色譜柱，靈敏度更高，分離速度更快(4.2min)，檢測限可達到0.007 μg/kg的效果。
謝文等在蜂蜜樣品中添加同位素內標氯霉素-d5，經乙酸乙酯提取，自制硅膠柱和Oasis HLB小柱凈化后用高效液相色譜—電噴霧電離質譜檢測，檢出限為0.1 μg/kg，相對標準偏差小于10％。
Kristin.E 等報道了用液相色譜與質譜聯用的方法對肉、海洋食品、蛋、蜂蜜、牛奶、血漿和尿中氯霉素殘留檢測，檢出限為0.02 μg/kg。
lshii R等報道液相色譜串聯質譜分析蜂蜜與王漿中的氯霉素，在液相色譜分離中采用Mightyl RP-18GP柱，以醋酸銨—乙腈為流動相，再用水稀釋，Oasis HLB柱凈化送人質譜檢測，氯霉素定量限為0.3 ng/g，在定量限的回收率高于92％。
陳舒舒等建立了反相高效液相色譜—離子阱質譜法檢測蜂蜜中氯霉素殘留的方法，其前處理采用的是QuEchERS方法進行快速提取與凈化，定性定量分析采用的是電噴霧電離法(ESl)負離子模式、多反應離子檢測器(MRM)，該法檢出限為0.1μg/kg，添加回收率水平在78％～93％間。
可見液相色譜—質譜聯用得到氯霉素檢測限一般為0.007～0.100 μg/kg，能得到很高的靈敏度，并且分離和定性定量能力強，值得在蜂蜜氯霉素殘留檢測中推廣應用。
5 生物傳感器法
生物傳感器(biosensors)又稱生物電極(bioelectrodes)，是近年來才發展起來的一類應用生物反應的新型傳感器，它是利用生物的或有生命物質分子的識別功能與信號轉換器相結合，將生物反應所引起的化學、物理變化變換成電信號、光信號等。
2004年 Julie F 等就報道了用表面等離共振生物傳感器與Qnexo氯霉素試劑盒檢測家禽肉、蜂蜜、對蝦和牛奶中氯霉素與氯霉素葡糖醛酸殘留，蜂蜜樣品需先用乙酸乙酯蘋取，然后表面等離子體共振對其中氯霉素與氯霉素葡糖醛酸殘留進行免疫化學篩選，在傳感器芯片上涂上氯霉素衍生物和抗體進行測定，檢出限為0.02 μg/kg，檢測力為0.02 μg/kg。
與傳統儀器相比生物傳感器成本更低，檢測精確度高，檢測判讀時間短，但傳感器的穩定性很難控制，在應用中會經常碰到傳感器輸出信號的穩定性問題，使得構建成的測定系統轉化成商品，由用戶來實現測定十分困難。
6 結語
以上所述對氯霉素殘留檢測方法中，酶聯免疫法具有特異、靈敏、快速、儀器簡單等優點，能在短短的幾個小時檢測幾十到上百個試樣，可以實現采樣現場的適時決速檢測，非常適合對氯霉素殘留篩選的需要。而高效液相色譜與質譜聯用法具有精確可靠、靈敏度高、重復性好以及假陽性少等優點，只要選擇出前處理條件和色譜、質譜條件，就能得到較滿意的結果，非常適合于實驗室進行科學研究。
預計今后，氯霉素殘留檢測技術主要是在這兩個方面上發展和完善。而有了檢測結果的技術支撐，將為衛生監督機構提供強有力的依法行政依據，以期協助國家提高蜂產品質量。
引自《蜜蜂雜志》2007（8）
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