蜜蜂人工授精技術研究進展及應用進展
吉林省養蜂科學研究所 薛運波
摘要：從國內外探索研究蜜蜂人工授精技術發展進程，人工授精技術對蜜蜂育種技術發展的影響，人工授精技術在蜜蜂育種工作中的應用以及蜜蜂人工授精技術的應用前景等4個方面進行了闡述，使人們對該技術能夠進一步加深了解和更好地發揮作用。蜜蜂人工授精技術的成功應用，推動了蜜蜂育種技術的發展，其重要性在于為蜜蜂細胞學研究、遺傳學研究和育種工作中原良種保存繁育、單群選擇、近交系、自交系、純系的培育以及大規模的雜交組合配制等提供了可靠高效的實驗手段。
關鍵詞：蜜蜂；人工授精技術；研究應用
1 蜜蜂人工授精技術的發展歷程
1.1 國外對蜜蜂人工授精技術的研究
文獻記載，人類在200多年以前開始探索蜜蜂人工授精技術。18世紀到19世紀初，人們探索蜜蜂人工授精的方式方法比較雜亂，有人把雄蜂精液滴在蜂王的蛹或成蟲上，也有人把雄蜂精液涂到未受精卵上，或者在蜂王體表的不同部位進行授精，但都沒有成功。1814年瑞士科學家F.于北，最早進行蜜蜂人工授精試驗，他用一種毛筆狀的工具，把雄蜂精液涂抹在蜂王陰道口上，雖然這個嘗試未能成功，但他的試驗給后來人以有益的啟示。1883年德國W.汪克勒設計了一個能插入蜂王陰道的注射針頭，稱其為“人工陰莖”，使用時裝在一只注射器上。1887年美國N.W.麥克萊恩用木板制造了一個蜂王夾板，把蜂王固定在夾板的凹槽里，夾板外露出蜂王腹部末端幾節，用一支皮下注射器和一枚加工過的針頭采集雄蜂精液并進行人工授精。19世紀末還有人采用玻璃細管進行采精，精液用生理鹽水稀釋后給蜂王授精。同一時期，多個國家先后出現了用手或簡單裝置把蜂王固定住，一手拿著雄蜂，試圖在人手的撮合下，使雄蜂和蜂王進行交配；后來，還有人把雄蜂精液滴入到性成熟蜂王打開著陰門里。進行這種“手持交配”經歷了一個很長的時期，從19世紀末到20世紀50年代很多人都進行了這種試驗。但是前蘇聯V.V.特里亞斯特經過多次認真試驗后得出的結論是：無論采用哪種“手持交配”的方法，精于進入蜂王受精囊的數量都很少，其精子數量只有自然交尾的0.5％～2.0％，沒有實用價值。此后，還有人把大量的雄蜂和蜂王囚禁在籠內進行交配嘗試，都沒有成功。1924年美國R L 沃森開始研究蜂王人工授精技術。他熟悉吹玻璃管技術，因而設計制造了微量注射器。1927年沃森設計成功了微量注射器和授精裝置，把微量注射器安裝在具有兩向導軌的巴伯吸量管操縱系統上，再組裝在體視顯微鏡臺上，控制注射器的移動，蜂王固定夾板用橡皮筋固定在鏡臺的另一端，用解剖鑷子張開蜂王的背腹板進行人工授精，結果取得了前所未有的成績。因此，世界公認沃森為現代蜜蜂人工授精技術的創始人，這種技術又稱之為蜂王器械授精。
1928年美國W.J.諾蘭掌握了沃森的蜂王授精器械操作技術后，設計制造了拉開蜂王螫針腔的彈夾、背鉤和腹鉤，用玻璃管制作成了蜂王固定器。1930年美國H.H.萊德勞將二氧化碳通入蜂王固定器的管內作為麻醉劑，使蜂王麻醉，便于人工授精操作。1931年萊德勞制造出了一個馬蹄形的彈夾，用以打開蜂王螫針腔。1933年萊德勞解剖了一些自然交尾后返回蜂巢的蜂王，他發現在蜂王陰道中部有一個舌狀陰道瓣突的作用如同一個閥門，在它突起時完全關閉中輸卵管的開口，對蜂王交配后防止精液外流和促使精于轉移到受精囊中有重要作用，同時得出結論，人工授精針頭必須越過陰道瓣突把精液注入到輸卵管內。他用一個細金屬環使陰道瓣突倒下，以露出中輸卵管口。1944年萊德勞根據蜂王陰道內的特殊結構，制造了用于壓低陰道瓣突的陰道探針，人工授精時讓針頭沿著陰道探針的背面順利進入到蜂王中輸卵管內。
20世紀30年代以后美國H.H.萊德勞、O.W.麥肯森、W.J.諾蘭、W.C.羅伯茨、J.R.哈博、德國F.魯特納以及前蘇聯T.A.阿維季相等人對蜜蜂人工授精注射器、針頭、蜂王麻醉器以及注射操縱裝置等部件不斷進行改進。
1944年美國W.C.羅伯茨等人發現蜂王有重復交配現象，蜂王須與6～9只雄蜂交配，認為對每只蜂王進行人工授精也須應用多只雄蜂的精液，才能達到與自然交尾相同的效果。1947年O.W.麥肯森發現，用二氧化碳作麻醉劑不僅對蜂王無害，而且還有消除發情反應和刺激蜂王提早產卵的作用。麥肯森還研究了隔膜式注射器，使人工授精的工作效率和成功率有了很大提高。
20世紀在世界上通用的麥肯森注射器就是以他的姓名命名的。麥肯森注射器研究成功后第3年，H.H.萊德勞設計了帶有螺旋推進導軌并與麥肯森注射器配套的人工授精儀，萊德勞還首先使用了抗生素的稀釋液，降低了細菌對精液的污染，提高了人工授精蜂王的成功率。20世紀80年代，德國F.魯特納等人又設計了一種結構精密、性能優良的多向導軌的人工授精儀。至此，蜜蜂人工授精技術、儀器設備以及理論研究，均達到相當高的水平。
2003年周瑋譯“小型萬維手動 schley Ⅱ型人工授精儀的改進”。該文介紹了 schley 公司長期致力于人工授精儀技術的教學實踐，面對眾多不同需求的學生工作，促使 schley 公司設備不斷改進創新，每次技術改進都使設備更加實用。對于嚴謹的蜜蜂育種工作者而言，蜜蜂人工授精技術是一項十分重要的技術，新型的 schley Ⅱ型人工授精儀它使得蜜蜂人工授精技術更加容易掌握。
1.1.1 雄蜂精液采集與常溫貯存及授精技術的研究進展
1969年美國 Poole 和 Taber 在試管內貯藏雄蜂精液已經獲得成功，在室溫下能夠將精液貯藏13個星期，1970年他們用麥肯森注射器采集精液，然后經過離心，火焰封口，在10～13℃下貯藏35個星期。并用麥肯森注射器采集精液，然后經過離心、火焰封口，進行貯藏。這種方法把精液從注射器轉注到毛細管不僅要花費時間，而且使精液容易受到污染。1974年 Harbo 設計了一種能在可裝卸的毛細管內注射器和貯存精液的注射器，毛細管的容量為50～60 μL，一端拉成針頭。使用這種注射器就不需要將精液轉注到貯藏管內，也不需要離心了，直接可進行人工授精。但是，它不能精確控制精液的移動，玻璃拉制的針頭和推桿容易破損。1980年 Katanoglu ＆ Peng 把麥肯森注射器的針頭加以改造，研究成功了一種新型注射器。這種新型注射器既可用來貯藏精液，又可進行人工授精。該注射器有良好的吸力，又有平衡壓力的泄壓孔，在拆裝時不覺動毛細管內的精液柱，還有一個精確的控制機構。每個貯藏管盛裝的精液可以給多只蜂王授精。同時他們還研究了采集雄蜂精液的漂洗技術。其精液采集器由漂洗精液的漏斗、聚乙烯連接管和精液采集管三部分組成。此漂洗方法操作容易而快速，無需借助于顯微鏡，在短時間內能夠容易地采集到大量的雄蜂精液，它比傳統的采集精液的方法更快速。
1.1.2 影響進入人工授精蜂王貯精囊內精子數量的研究
1944年以前人們認為蜂王只與一只雄蜂交配，因此早期蜜蜂人工授精僅以1.0～2.5 mm3 (μL)精液來授精，其進入蜂王貯精囊內精子數量平均沒有顯著差別。
1951年 Trysko，1954年 Tdber，1955年 Woyke 發現蜂王在一次婚飛中可進行多次交配。1960年波蘭J.Woyke發現一次成功的自然交尾后的蜂王在它們貯精囊內大約有5.34百萬個精于。一個雄蜂可射出11百萬個精子，幾乎是蜂王貯精囊裝載的2倍。然而用1 mm3 精液約7.0百萬個精子給蜂王人工授精時，僅有1.39百萬個精子(20％)進人蜂王貯精囊，若使用8 mm3 精液(約56百萬個精于)給蜂王進行人工授精，進入蜂王貯精囊內的精于只有授精量的9.6％；1964年美國 Mackense 的試驗為5.2％。因此，Woyke 建議凡僅一次人工授精的蜂王可用8 mm3 精液。分作兩次人工授精時，每次可用4 mm3 精液，并認為進人蜂王貯精囊內的精子數多少取決于注射精液數量(Mackense，1964)。1960年 Woyke，1975年 Foti 發現自然交尾的蜂王，貯精囊較大的比貯精囊較小的含有更多的精子數。
1970年 Vesely 授精后的蜂王放在核群內自由活動，則它的輸卵管內的精液會排除干凈，可增加進入貯精囊的精子數。反之，蜂王被保存在紗籠內，則精液會滯留在輸卵管內。1967年、1971年 Woyke 移植最小的幼蟲培育出的蜂王，可增加貯精囊進入的精子數。1973年 Woyke ＆ Jasinski 授精后把蜂王保存在溫度為34℃處，比把蜂王放回溫度較低的哺育籠內進入貯精囊內的精于數量多。1974年 Woyke，Jasinski 和 Smagowska 發現，用相等數量的精液不同種系的蜂王進行人工授精，其貯精囊內的精子數目在統計學上意大利蜂)(高加索蜂的雜交王顯著高于高加索蜂x卡尼鄂拉蜂的雜交蜂王。1975年 Foti，Grosu和D，agan 報道，蜂王在授精前后與30只工蜂一起關在籠內，其結果與蜂王保持在核群內一樣。1976年 Woyke 和 Jasinski 當蜂王達到5～14日齡時可進行人工授精。
1979年 Woyke 報道了工蜂與蜂王的接近對人工授精結果的影響，總共96只蜂王，各以8 mm3 精液進行人工授精，授精后的蜂王被分放到：1)在不伴有工蜂的哺育紗籠內；2)帶有10個工蜂的哺育紗籠內；3)具有隔王片的哺育籠內；4)在兩面具有隔王片的10 × 6.5×2.5 cm的雄蜂蜂籠內；5)在兩面具有隔王板片帶有巢脾的16× 6.5×2.5 cm的小隔離器內；6)在能夠遮蓋整個巢脾26×36 cm具有隔王板片的大型隔離器內。授精后48 h解剖蜂王，檢查輸卵管內精于的存在，并計算貯精囊內的精子數，其結果是：在紗籠里無論有無工蜂伴隨蜂王，有5.6％的蜂王輸卵管內有殘留的精液；而保存在隔王籠或隔王器內的蜂王，有4.7％的蜂王輸卵管內有殘留的精液。在沒有工蜂伴隨的紗籠內的蜂王，其貯精囊內只有3.02百萬個精子；在配備有隔王片的隔離器內的蜂王，其貯精囊的精子增加75％。因此，建議授精后的蜂王應放在有隔王片制造的隔王器內的巢脾上，直到它開始產卵。
1982年 Woyke 等人報道了伴隨工蜂數量對保存的室外小交尾群的人工授精蜂王貯精囊內精子數的影響將160只蜂王全部用8 mm3 精液授精，分別放入1脾和4脾兩種類型的交尾箱內，每10群為一組，8 組每小群的工蜂數分別為：0只，50只，100只，200只，350只，500只，750只，1000只。小群放在室外，每天分別在8∶30，13∶00和20∶00用熱電偶測定箱內外溫度。授精2天后，20只蜂王中除了5只沒有工蜂伴隨的死亡外，其余蜂王的輸卵管中仍留有殘余的精液。幾乎所有由100只或更多伴隨工蜂的蜂王的輸卵管內有殘余的精液。1脾或4脾沒伴有工蜂的小群中的蜂王貯精囊內精子量最少為1.4百萬和1.2百萬。50只有工蜂伴隨的蜂王貯精囊內精于數量有兩倍增加。達到2.6百萬和2.7百萬。工蜂數量增加到200只時，貯精囊內精子數量僅稍有增加，但當伴隨蜂數增加到350只時，貯精囊內精子數達到3.7百萬和3.6百萬。為沒有工蜂伴隨的蜂王精子數的3倍，為有50只伴隨工蜂的蜂王精子數的1.4倍，進一步增加工蜂數直到1000只，貯精囊內精于只有很少或沒有增加，平均為3.95百萬和3.68百萬，差異不顯著。伴隨工蜂數量的增加，使蜂群溫度從18.0 ℃升至31.6℃。為使蜂王貯精囊得到正常數量的精于，室外小核群中的人工授精蜂王至少要有350只伴隨工蜂。
1982年美國A.B.伯爾坦等報道了少量多次授精與蜂王貯精囊中的精于量，用少量的稀釋精液給蜂王多次授精，進人貯精囊中的精子數量顯著多于等劑量的一次性授精（P＜0.01)。數次相同的小劑量授精，第二次授精進入貯精囊中的精于數量高于第一次，使用液態氮(-196℃)貯存的精液，在不同的兩組試驗中，第二次授精進入貯精囊的精子數分別占總數的77％和68％，用新鮮的稀釋精液時第二次占61％。
1983年 Woyke 報道精于進人人工授精蜂王貯精囊的動態，授精1 mm3 ，2 mm3 ，4 mm3 或8 mm3 的蜂王，每只蜂王帶伴隨工蜂250只，放在34℃溫箱內或不帶工蜂關在無王群內，最初4 h授精量與有無工蜂對精于進入貯精囊的速度影響極小，為20～30萬/h。授精1 mm3 和2 mm3 的蜂王，4～8 h后轉移過程基本結束，但授精8 mm3 的蜂王，至少要延長到40 h。有無工蜂，在授精1 mm3 或2 mm3 時，對貯精囊內最后精于數只有小的或沒有影響。而授精4 mm3 或8 mm3 時，和工蜂關在一起的蜂王貯精囊內的精子數明顯多于不帶工蜂的蜂王。因此，在采用大精液量授精時，工蜂和蜂王關在一起是很重要的。
1992年拜斯.B報道了“溫度對人工授精蜂王的影響”。該文介紹了海角蜜蜂蜂王自然交尾后，貯精囊內有精于659萬。而人工授精8 mm3 精液，貯精囊內才有精子503萬。人工授精量每次以4mm3 較好，用8mm3 時則精液量過大，反而妨礙了精子進入貯精囊內。實驗證明，人工授精前后，蜂王放入王籠內，用200只工蜂陪侍，溫度保持在34℃，相對濕度40％最為適宜。相對濕度越高，進入貯精囊內的精子數越少。
1.2 國內蜜蜂人工授精技術的研究
我國早期見于報刊介紹蜂王人工授精技術的是舒少質先生，他在1929年《華北養蜂》月刊第1卷第6期刊發了“蜂王人工授精法之現實”。周慶章先生在1932年《養蜂月刊》第3卷第2期、第4期、第7期，1933年第4卷第3～5期刊發了“蜂王人工交配之研究”。鄒雪蓉、李怕琳、鄭國安在1963年《中國養蜂》第2期刊發了“蜂王人工授精技術”。
20世紀50年代末，我國蜜蜂人工授精技術進人應用研究階段。1959年現代養蜂家、北京市農林科學院周崧研究員進行了人工授精技術研究，他在玻璃授精針頭、授精儀的改進以及仿雄蜂生殖器授精針頭等方面進行了研究和探討，1964年蜂王人工授精技術在育種工作中得到實際應用。
1964年現代養蜂家、中國農科院蜜蜂研究所黃文誠研究員主持“蜂王人工授精技術的研究”，突破了向蜂王生殖道內注射精液外溢的技術難關，人工授精的蜂王85％以上都能產受精卵。
1978年中國農科院蜜蜂研究所受農業部委托，在江西舉辦了第一期‘全國蜜蜂人工授精技術訓練班”，正式向全國養蜂重點區和有關教學、科研等單位推廣這一新技術。
1978年陳克利在《中國養蜂》第3期發表“蜜蜂人工授精”，介紹了蜜蜂人工授精的實驗設備和操作方法，并通過試驗表明2次授精比1次授精的效果要好，兩次授精每次6 μL或8 μL，一次授精為7～9 μL。