蜂王漿新鮮度指標和評價方法研究
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蜂王漿的新鮮度與其品質密切相關，其新鮮度指標和評價方法已成為國內外蜂王漿研究的熱點之一。中國農業科學院蜜蜂研究所副研究員、浙江大學在職博士吳黎明今年6月通過了其《蜂王漿新鮮度指標和評價方法研究》的博士論文答辯,受到了專家的一致好評。該論文利用液相色譜和紅外光譜技術，從微觀到宏觀，從定性、半定量到定量建立了多種評判蜂王漿新鮮度的方法，為進一步進行蜂王漿新鮮度和品質相關研究打下了基礎，也為完善現行蜂王漿質量標準提供了理論依據。 長期的科學研究和實踐經驗表明，蜂王漿的品質和保健功效易受其貯存條件的影響。若貯存溫度過高或時間過長，蜂王漿的物理性狀、化學組成會發生變化，保健功效降低甚至喪失。也就是說，蜂王漿的新鮮度與其品質密切相關，并具有一定的正相關性。但迄今為止，尚沒有一個公認的蜂王漿新鮮度的控制指標，也沒有一種適合的評價方法。缺少新鮮度指標及相應的評價方法是現行蜂王漿國家質量標準的一大缺陷，也使質量監管部門及加工、貿易企業無法在蜂王漿生產和流通過程中進行有效地監管和控制，難以對蜂王漿質量做出準確的評價。因此，探求并確立能如實反映蜂王漿新鮮度的指標及評價方法是蜂王漿研究的一項重要課題，也是完善現行蜂王漿質量標準，有效監控蜂王漿質量，進一步規范蜂王漿市場的關鍵所在。 針對上述問題，本文利用液相色譜技術對不同貯存條件下的蜂王漿中6種糠醛和26種氨基酸進行了定量分析和比較，同時利用紅外光譜技術對不同貯存條件下的蜂王漿進行了相關分析和蛋白質的二級結構鑒定，初步建立了蜂王漿新鮮度監控的方法。研究結果如下：
1. 選定有可能反映蜂王漿新鮮度的糠醛類物質為研究對象，建立了同時測定蜂王漿中5-羥甲基-2-糠醛 (5-HMF)、5-甲基糠醛 (5-MF)、2-糠醛 (F)、2-糠酸 (2-OIC)、3-糠酸 (3-OIC)、5-羥甲基-2-糠酸 (5-HMFacid) 6種糠醛類物質含量的高效液相色譜分析方法。蜂王漿樣品用去離子水提取，離心沉淀后，取上清液加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液沉降蛋白，0.45 μm濾膜過濾，用高效液相色譜儀在不同波長下測定。在測試范圍內，6種糠醛類物質的濃度與相應的峰面積呈線性關系，相關系數 (R2) 不小于0.9993。方法定量和定性檢出限分別在0.07～0.26 μg/mL和0.02～0.08 μg/mL之間，加標回收率為86.2%～99.7%，相對標準偏差小于2.40%。方法操作簡單，靈敏度高，是一種適合蜂王漿中糠醛類化合物測定的方法。 利用該方法定量測定了在不同溫度下 (-18℃，4℃，16℃和25℃) 經過不同時間 (1，3，6，9和12個月) 貯存的蜂王漿中6種糠醛類物質的含量。結果表明，在新采收的蜂王漿中沒有檢出這6種化合物；而在經過不同時間貯存后，4個溫度梯度的樣品中均檢出了5-HMF，其含量隨著貯存時間增加和溫度升高而增加；在12個月的試驗期內，僅在25℃下貯存的蜂王漿中檢出了F。根據5-HMF和F含量與貯存時間和溫度的相關性，結合蜂王漿貯存的實踐經驗，本文提出以5-HMF和F作為評價蜂王漿新鮮度的指標，并初步確定5-HMF含量小于150 μg/kg和F不得檢出作為評判蜂王漿是否新鮮的標準。
2. 選定可能能代表蜂王漿新鮮度的26種氨基酸，探索了它們的提取過程以及利用超高效液相色譜 (UPLC) 分析的條件，建立了一種分析蜂王漿中26種氨基酸的UPLC分析方法。該方法采用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯(AQC) 柱前衍生，通過梯度洗脫，使用ACCQ?Tag C18氨基酸分析柱在8 min以內同時分離并定量測定了蜂王漿中的26種氨基酸含量。在測試范圍內，26種氨基酸的濃度與相應的峰面積呈線性關系，相關系數 (R2) 不小于0.9978。方法定量 (LOQ) 和定性檢出限 (LOD) 分別在42.7～235.1 ng/mL和12.9～69.3 ng/mL之間，加標回收率為90.1%～100.9%，相對標準偏差小于2.8%。方法操作簡單，耗時短，靈敏度高，是一種適合蜂王漿的氨基酸測定方法。
利用該方法定量測定了在不同溫度下 (-18℃，4℃和25℃) 經過不同時間 (1，3，6和10個月) 貯存的蜂王漿中游離氨基酸和總氨基酸含量。結果表明，新鮮蜂王漿的游離氨基酸和總氨基酸總量分別為9.21 mg/g和111.27 mg/g；其中最主要的游離氨基酸為Pro、Gln、Lys和Glu，而含量最高的總氨基酸分別為Asp、Glu、Lys和Leu。盡管多數游離氨基酸和總氨基酸含量在蜂王漿的貯存過程中并沒有發生明顯的變化或變化無規律，但總Met和游離Gln在貯存過程中含量持續下降而且差異顯著。因此，本文提出總Met和游離Gln有可能作為評價蜂王漿品質和新鮮度的指標。
3. 測定了在不同溫度下經過不同時間貯存后蜂王漿的Fourier變換紅外光譜，以新采收蜂王漿的紅外譜圖為參考標準譜，利用光譜比對軟件進行了一系列的相關分析，同時比較了紅外譜圖中1647、1541、1409、1247和1054 cm-1 5個峰位的相對峰強。結果表明：不同貯存條件下的蜂王漿紅外譜圖之間存在著明顯差異；紅外光譜圖中酰胺Ⅰ帶 (1700～1600 cm-1) 波段的相關系數隨著蜂王漿貯存時間延長和溫度升高而降低；相對峰強度I1647/I1541、I1647/I1409、I1647/I1247和I1647/I1054也隨著蜂王漿貯存時間延長和溫度升高而降低，且與貯存時間存在著良好的線性關系，變化幅度為28℃＞16℃＞4℃＞-18℃。因此，初步選定紅外光譜圖中酰胺Ⅰ帶特征波段的相關系數和4個相對峰強度（I1647/I1541、I1647/I1409、I1647/I1247和I1647/I1054）作為蜂王漿新鮮度的評價指標，相關系數的閾值設定為0.9100，4個相對峰強度的閾值分別設定為1.744、2.430、3.345和1.412。只要有1個或多個指標低于相應的閾值，可初步判定此蜂王漿是不新鮮的。該方法利用FTIR光譜法并結合計算機輔助解析技術能從宏觀上和整體上快速地評價蜂王漿的新鮮度。
4. 測定了在不同溫度下經過不同時間貯存后蜂王漿Fourier變換紅外光譜圖，應用去卷積和曲線擬合方法對蜂王漿的酰胺Ⅰ帶進行了蛋白質的二級結構分析，半定量地分析了在不同儲存條件下蛋白質二級結構的相對含量的變化規律。結果表明：經過不同條件貯存的蜂王漿蛋白質二級結構的相對含量存在顯著差異。隨著貯存時間增加和溫度升高，蛋白質二級結構的α-螺旋相對含量顯著減少，而β-折疊相對含量顯著增加。其變化幅度為28℃＞16℃＞4℃＞-18℃。因此，FTIR光譜法結合去卷積和曲線擬合技術可以對蜂王漿中蛋白質的二級結構進行宏觀評價和進行半定量分析，也可以作為蜂王漿新鮮度評價的參考依據。 綜上所述，本文利用液相色譜法分析測定了不同條件下貯存的蜂王漿6種糠醛類物質和26種氨基酸的含量，選定了5-HMF、F、總Met和游離Gln作為蜂王漿新鮮度的評價指標，并設定了相應的閾值；同時利用紅外光譜法并結合相關分析和曲線擬合技術分析了在不同貯存條件下蜂王漿紅外譜圖的相關性和蛋白質二級結構相對含量的變化規律。本文利用液相色譜和紅外光譜技術，從微觀到宏觀，從定性、半定量到定量建立了多種評判蜂王漿新鮮度的簡單易行方法，為進一步進行蜂王漿新鮮度和品質相關研究打下了基礎，也為完善現行蜂王漿質量標準，如實評價和有效監控蜂王漿質量，進一步規范蜂王漿市場提供了理論依據。
1. 選定有可能反映蜂王漿新鮮度的糠醛類物質為研究對象，建立了同時測定蜂王漿中5-羥甲基-2-糠醛 (5-HMF)、5-甲基糠醛 (5-MF)、2-糠醛 (F)、2-糠酸 (2-OIC)、3-糠酸 (3-OIC)、5-羥甲基-2-糠酸 (5-HMFacid) 6種糠醛類物質含量的高效液相色譜分析方法。蜂王漿樣品用去離子水提取，離心沉淀后，取上清液加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液沉降蛋白，0.45 μm濾膜過濾，用高效液相色譜儀在不同波長下測定。在測試范圍內，6種糠醛類物質的濃度與相應的峰面積呈線性關系，相關系數 (R2) 不小于0.9993。方法定量和定性檢出限分別在0.07～0.26 μg/mL和0.02～0.08 μg/mL之間，加標回收率為86.2%～99.7%，相對標準偏差小于2.40%。方法操作簡單，靈敏度高，是一種適合蜂王漿中糠醛類化合物測定的方法。 利用該方法定量測定了在不同溫度下 (-18℃，4℃，16℃和25℃) 經過不同時間 (1，3，6，9和12個月) 貯存的蜂王漿中6種糠醛類物質的含量。結果表明，在新采收的蜂王漿中沒有檢出這6種化合物；而在經過不同時間貯存后，4個溫度梯度的樣品中均檢出了5-HMF，其含量隨著貯存時間增加和溫度升高而增加；在12個月的試驗期內，僅在25℃下貯存的蜂王漿中檢出了F。根據5-HMF和F含量與貯存時間和溫度的相關性，結合蜂王漿貯存的實踐經驗，本文提出以5-HMF和F作為評價蜂王漿新鮮度的指標，并初步確定5-HMF含量小于150 μg/kg和F不得檢出作為評判蜂王漿是否新鮮的標準。
2. 選定可能能代表蜂王漿新鮮度的26種氨基酸，探索了它們的提取過程以及利用超高效液相色譜 (UPLC) 分析的條件，建立了一種分析蜂王漿中26種氨基酸的UPLC分析方法。該方法采用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯(AQC) 柱前衍生，通過梯度洗脫，使用ACCQ?Tag C18氨基酸分析柱在8 min以內同時分離并定量測定了蜂王漿中的26種氨基酸含量。在測試范圍內，26種氨基酸的濃度與相應的峰面積呈線性關系，相關系數 (R2) 不小于0.9978。方法定量 (LOQ) 和定性檢出限 (LOD) 分別在42.7～235.1 ng/mL和12.9～69.3 ng/mL之間，加標回收率為90.1%～100.9%，相對標準偏差小于2.8%。方法操作簡單，耗時短，靈敏度高，是一種適合蜂王漿的氨基酸測定方法。
利用該方法定量測定了在不同溫度下 (-18℃，4℃和25℃) 經過不同時間 (1，3，6和10個月) 貯存的蜂王漿中游離氨基酸和總氨基酸含量。結果表明，新鮮蜂王漿的游離氨基酸和總氨基酸總量分別為9.21 mg/g和111.27 mg/g；其中最主要的游離氨基酸為Pro、Gln、Lys和Glu，而含量最高的總氨基酸分別為Asp、Glu、Lys和Leu。盡管多數游離氨基酸和總氨基酸含量在蜂王漿的貯存過程中并沒有發生明顯的變化或變化無規律，但總Met和游離Gln在貯存過程中含量持續下降而且差異顯著。因此，本文提出總Met和游離Gln有可能作為評價蜂王漿品質和新鮮度的指標。
3. 測定了在不同溫度下經過不同時間貯存后蜂王漿的Fourier變換紅外光譜，以新采收蜂王漿的紅外譜圖為參考標準譜，利用光譜比對軟件進行了一系列的相關分析，同時比較了紅外譜圖中1647、1541、1409、1247和1054 cm-1 5個峰位的相對峰強。結果表明：不同貯存條件下的蜂王漿紅外譜圖之間存在著明顯差異；紅外光譜圖中酰胺Ⅰ帶 (1700～1600 cm-1) 波段的相關系數隨著蜂王漿貯存時間延長和溫度升高而降低；相對峰強度I1647/I1541、I1647/I1409、I1647/I1247和I1647/I1054也隨著蜂王漿貯存時間延長和溫度升高而降低，且與貯存時間存在著良好的線性關系，變化幅度為28℃＞16℃＞4℃＞-18℃。因此，初步選定紅外光譜圖中酰胺Ⅰ帶特征波段的相關系數和4個相對峰強度（I1647/I1541、I1647/I1409、I1647/I1247和I1647/I1054）作為蜂王漿新鮮度的評價指標，相關系數的閾值設定為0.9100，4個相對峰強度的閾值分別設定為1.744、2.430、3.345和1.412。只要有1個或多個指標低于相應的閾值，可初步判定此蜂王漿是不新鮮的。該方法利用FTIR光譜法并結合計算機輔助解析技術能從宏觀上和整體上快速地評價蜂王漿的新鮮度。
4. 測定了在不同溫度下經過不同時間貯存后蜂王漿Fourier變換紅外光譜圖，應用去卷積和曲線擬合方法對蜂王漿的酰胺Ⅰ帶進行了蛋白質的二級結構分析，半定量地分析了在不同儲存條件下蛋白質二級結構的相對含量的變化規律。結果表明：經過不同條件貯存的蜂王漿蛋白質二級結構的相對含量存在顯著差異。隨著貯存時間增加和溫度升高，蛋白質二級結構的α-螺旋相對含量顯著減少，而β-折疊相對含量顯著增加。其變化幅度為28℃＞16℃＞4℃＞-18℃。因此，FTIR光譜法結合去卷積和曲線擬合技術可以對蜂王漿中蛋白質的二級結構進行宏觀評價和進行半定量分析，也可以作為蜂王漿新鮮度評價的參考依據。 綜上所述，本文利用液相色譜法分析測定了不同條件下貯存的蜂王漿6種糠醛類物質和26種氨基酸的含量，選定了5-HMF、F、總Met和游離Gln作為蜂王漿新鮮度的評價指標，并設定了相應的閾值；同時利用紅外光譜法并結合相關分析和曲線擬合技術分析了在不同貯存條件下蜂王漿紅外譜圖的相關性和蛋白質二級結構相對含量的變化規律。本文利用液相色譜和紅外光譜技術，從微觀到宏觀，從定性、半定量到定量建立了多種評判蜂王漿新鮮度的簡單易行方法，為進一步進行蜂王漿新鮮度和品質相關研究打下了基礎，也為完善現行蜂王漿質量標準，如實評價和有效監控蜂王漿質量，進一步規范蜂王漿市場提供了理論依據。
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