摘 要：本試驗(yàn)以果蠅（Drosophila melanogaster）ATP合成酶16kDa蛋白脂質(zhì)C亞基基因（vha16）cDNA序列為信息探針，對(duì)蜜蜂EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源檢索篩選，克隆了蜜蜂ATP合成酶 16kDa蛋白脂質(zhì)C亞基基因（vha16）的cDNA全序列（GenBank登記號(hào)為AY343324），該基因全長(zhǎng)581bp。經(jīng)RT-PCR克隆、序列分析驗(yàn)證，結(jié)果表明與電子克隆序列完全一致。該基因具有完整的開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼蛋白為156個(gè)氨基酸。通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物，克隆到長(zhǎng)為2 968bp的該基因的部分基因組序列。利用Gene Finder軟件分析發(fā)現(xiàn)，在蜜蜂vha16基因組序列的第1~133位、第1 965~2 154位和第2 711~2 968位分別為外顯子；2個(gè)內(nèi)含子分別位于第134~1 964位和第2 155~2 710位，且內(nèi)含子的剪切位置均符合GT-AG規(guī)則。

關(guān)鍵詞：蜜蜂（Apis mellifera）；電子克隆；TR-PCR；ATP合成酶16kDa蛋白脂質(zhì)C亞基基因（vha16）；基因結(jié)構(gòu)

基于表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，ESTs）的電子克隆（in silico cloning）策略，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一門快速克隆基因的新技術(shù)，其技術(shù)核心是利用生物信息學(xué)技術(shù)組裝延伸ESTs序列，獲得基因的部分乃至全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)一步利用RT-PCR的方法進(jìn)行克隆分析、驗(yàn)證。隨著EST數(shù)據(jù)庫(kù)的進(jìn)一步完善，電子克隆策略已成為克隆新基因的重要方法，并成功地應(yīng)用于人類基因組的研究[1-3]。在過(guò)去的幾年間，在許多動(dòng)物的質(zhì)膜上都發(fā)現(xiàn)了運(yùn)輸質(zhì)子的液泡型ATP合成酶（vacuolar-type ATPase，V-ATPase）[4-7]。在昆蟲(chóng)的生理系統(tǒng)中，V-ATPase起著至關(guān)重要的作用，它可以產(chǎn)生穿膜電壓，為次級(jí)主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程如K+/2H+逆向、氨基酸/K+同向跨越質(zhì)膜運(yùn)輸提供能量[8-9]。而蜜蜂（Apis mellifera）V-ATPase基因序列尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用電子克隆的方法，以果蠅（Drosophila melanogaster）ATP合成酶16kDa蛋白脂質(zhì)C亞基基因（vha16）cDNA序列為信息探針，BLAST檢索GenBank的蜜蜂EST數(shù)據(jù)庫(kù)，拼接有部分同源的EST序列，獲得蜜蜂vha16基因的cDNA全序列并經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證。并在該基因的cDNA序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)系列特異引物，進(jìn)一步克隆了蜜蜂vha16基因組部分序列，并分析該基因組序列的結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌株及蜜蜂

克隆載體pMD-T為TaKaRa公司產(chǎn)品；宿主菌E. coli TG1為本實(shí)驗(yàn)室保存。試驗(yàn)所用蜜蜂由福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院教學(xué)蜂場(chǎng)提供。

1.1.2 工具酶及試劑

T4 DNA連接酶、plus Taq DNA聚合酶、蛋白酶K及各種限制性內(nèi)切酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為MBI產(chǎn)品；DNA Marker 購(gòu)自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA[10]

取0.5g成年工蜂的頭部組織，加入10ml Trizol冰浴研磨，然后加入終濃度為0.3g·L-1的糖原，用1ml注射器反復(fù)吸打。室溫放置5min后加入2ml氯仿，劇烈混合3min，11 000r/min離心15min。上清移至無(wú)菌且RNase free的離心管中，加入2倍體積乙醇，12 000r/min離心5min；棄上清，以75%乙醇洗滌沉淀2次。稍干后，用無(wú)RNase的滅菌水溶解沉淀。cDNA的合成按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.2.2 蜜蜂基因組DNA的提取

取成年工蜂10只，參照LIFTOND的方法[11]提取蜜蜂基因組DNA，干燥后溶于100 μL TE，-20℃保存?zhèn)溆谩?

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)電子克隆所得的完整cDNA序列，設(shè)計(jì)合成特異引物（由上海生工生物工程公司合成）：

引物1：F：5’-CGACAACCTGTAAATACTCGTG-3’

R：5’-GGTTGCAGGCGACGAGTCTTGC-3’

引物2：F：5’-CGACAACCTGTAAATACTCGTG-3’

R：5’-TGTACCTGACTTTGCTGTGCCG-3’

引物3：F：5’-GTTCTAATTGCTGGTGGTCTAG-3’

R：5’-GGTTGCAGGCGACGAGTCTTGC-3’

1.2.4 PCR擴(kuò)增蜜蜂vha16基因片段

用所設(shè)計(jì)的引物1，以供試蜜蜂cDNA為模板擴(kuò)增特異片段。PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，54℃復(fù)性45 s，72℃延伸1 min。共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。反應(yīng)完畢后取10 μl于15g·L-1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.2.5 蜜蜂vha16基因組序列克隆

分別用所設(shè)計(jì)的特異引物2、3，以供試蜜蜂基因組DNA為模板，用plus Taq酶擴(kuò)增特異片段。PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，56℃復(fù)性45 s，72℃延伸90 s。共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。反應(yīng)完畢后取10 μL于12g·L-1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.2.6 重組、克隆和DNA序列分析

用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，與pMD-T載體（摩爾比3:1）連接，挑選陽(yáng)性克隆，委托TaKaRa公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。

1.2.7 蜜蜂vha16基因組序列內(nèi)含子/外顯子分析

利用Gene Finder軟件（http://www.bioscience.org/urllists/genefind.htm）進(jìn)行基因組序列的內(nèi)含子和外顯子分析。將蜜蜂vha16基因的cDNA序列和相應(yīng)的基因組序列進(jìn)行對(duì)齊顯示，以確定該基因的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。部分區(qū)域根據(jù)典型的剪切位點(diǎn)（GT-AG法則）進(jìn)行調(diào)整。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜜蜂vha16基因cDNA序列的電子克隆

從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的GenBank的核酸（nr）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索昆蟲(chóng)vha16基因，獲得果蠅的vha16基因cDNA序列NM_05745[12]，以該序列為模板對(duì)蜜蜂EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST檢索，獲得與之部分同源的蜜蜂EST群，從中選取一條EST（BI513093）作為種子序列BLAST檢索蜜蜂EST數(shù)據(jù)庫(kù)，將檢出與種子序列同源性較高或有部分重疊的EST序列拼接組裝為重疊群（contig），再以此重疊群序列重復(fù)以上BLAST檢索過(guò)程，反復(fù)進(jìn)行EST重疊群序列的拼接和比對(duì)，直至檢出所有的重疊EST或重疊群不能繼續(xù)延伸[13]，最終獲得581bp的蜜蜂vha16基因的cDNA全序列，由蜜蜂dbEST中的BI513093、BI513122、BI514568、BI511976、BI508009、BI505241和BI511110等EST序列拼接而成（圖1）；經(jīng)RESearch軟件分析，發(fā)現(xiàn)其具有完整的開(kāi)放式閱讀框架（ORF），起始密碼子在第59位，終止密碼子在第527位，推測(cè)編碼156個(gè)氨基酸。

圖 1 蜜蜂vha16 cDNA序列在蜜蜂EST數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果

2.2 RT-PCR驗(yàn)證

PCR結(jié)果經(jīng)15g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果出現(xiàn)單一條帶，約570bp，與預(yù)計(jì)大小相符（圖2）。用pMD-T載體克隆后測(cè)序，結(jié)果與電子克隆序列一致（圖3）。蜜蜂vha16基因的完整序列的GenBank登記號(hào)為AY343324。

圖 2 蜜蜂vha16 cDNA RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定

1: RT-PCR產(chǎn)物; 2: DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量

2.3 蜜蜂vha16基因組序列克隆

分別用所設(shè)計(jì)的特異引物2、3擴(kuò)增特異片段，PCR結(jié)果經(jīng)12g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果出現(xiàn)單一條帶，分別約為2126bp和978bp（圖未列）。用pMD-T載體克隆后測(cè)序所得的2個(gè)片段序列，有146bp的重疊區(qū)域，結(jié)合電子克隆序列，可拼接獲得長(zhǎng)為2 968bp序列（篇幅所限，序列未列出），但cDNA兩端序列未能得到延伸。

2.4 基因結(jié)構(gòu)分析

利用Gene Finder軟件分析基因組序列的內(nèi)含子和外顯子發(fā)現(xiàn)，對(duì)蜜蜂vha16基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，在其第1~133位、第1 965~2 154位和第2 711~2 968位分別為外顯子；2個(gè)內(nèi)含子分別位于第134~1 964位和第2 155~2 710位，且內(nèi)含子的剪切位置均符合GT-AG規(guī)則。

3 討論

利用EST資料的電子克隆是克隆功能基因的新途徑，與傳統(tǒng)的基因克隆方法相比，具有快捷、成本低、針對(duì)性強(qiáng)等特點(diǎn)，但也受到dbEST的EST數(shù)量和質(zhì)量的限制[14]，因此在EST資料非常豐富的模式物種（如人、鼠等）中應(yīng)用較多。在實(shí)際應(yīng)用中，以模式物種某一已知基因序列為起點(diǎn)，結(jié)合目標(biāo)物種EST數(shù)據(jù)庫(kù)，采用現(xiàn)代生物信息學(xué)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的技術(shù)方法，尤其是通過(guò)同源性比較完全有可能快速篩選到一些具有重要功能的基因。

同時(shí)，通過(guò)蛋白同源比較也可看出，蜜蜂vha16基因的推測(cè)蛋白與已知昆蟲(chóng)VHA16的大小相似。所以，筆者認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)中電子克隆的蜜蜂vha16基因cDNA序列是完整的，至少可以說(shuō)該基因的cDNA序列，推測(cè)編碼的蛋白序列是完整的，具有完整的ORF。在該基因的結(jié)構(gòu)分析研究中，曾試圖擴(kuò)增非轉(zhuǎn)錄區(qū)序列，但未能取得成功，這對(duì)于全面分析該基因的結(jié)構(gòu)有一定的影響。

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陳大福 福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院