摘 要：從中華蜜蜂(Apis.cerana cerana)線粒體DNA 中擴增出完整的細胞色素氧化酶II（Ac-COII）和III（Ac-CoIII）基因。兩者長度分別為681bp和780bp，Ac-CoII可編碼226個氨基酸殘基的多肽，與意大利蜜蜂在核苷酸水平和氨基酸水平的一致性分別為90％和95％。Ac-CoIII可編碼259個殘基的蛋白，與意大利蜜蜂在核苷酸水平和氨基酸水平的一致性分別為84％和79％。利用COII的序列信息進行分析能夠反映各不同蜜蜂種類之間的系統(tǒng)進化關系。

關鍵詞：細胞色素氧化酶II和III；中華蜜蜂；序列分析；分子進化

線粒體是細胞重要的細胞器，上面分步許多與呼吸代謝相關的酶類，是生物能量代謝的主要場所，在維系細胞正常功能方面具有重要的作用[1]。線粒體具有自主獨立的基因復制和遺傳方式，在生物體體內是母系遺傳的。因而在研究物種的系統(tǒng)進化關系方面具有重要的意義。圍繞不同生物種類的線粒體基因、基因組序列已經完成了許多工作[2-4]，對于我們理解線粒體的功能和相關物種的系統(tǒng)進化關系具有重要作用。

意大利蜜蜂的線粒體基因組測序工作已經完成[5]，上面總共編碼22個轉移RNA基因，13個與呼吸代謝密切相關的代謝酶類和2個核糖體基因。由于線粒體基因是母系遺傳的，在研究物種之間的系統(tǒng)進化關系具有重要意義，蜜蜂線粒體的許多蛋白編碼基因包括NADH, 16sRNA, 28sRNA, COII, COI, ATPase[6-8]等均曾被用于分析物種之間的系統(tǒng)進化關系。

中華蜜蜂是我國的一個有重要經濟價值的蜜蜂種類，在我國大面積飼養(yǎng)。其傳統(tǒng)的分類學地位只是在形態(tài)學的指標上予以說明。在基因水平上是什么情況還沒有工作涉及。本研究克隆了中華蜜蜂細胞色素氧化酶的II單位和III單位基因，并與GenBank內的蜜蜂同源序列進行比對和系統(tǒng)進行關系的分析，以期從分子的角度對我國中華蜜蜂的分類地位予以確定，為相關的研究提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

中華蜜蜂采自浙江大學昆蟲研究所蜂場，PGEM –T easy 載體、Taq DNA 聚合酶購自Promega公司, Trizol、EcoRI，DNA Marker,低熔點凝膠購自Takara 公司, TG1為宿主菌。

1.2 方法

1.2.1 蜜蜂線粒體基因組DNA的提取

蜜蜂線粒體基因組DNA的提取按照Crozier 等[9]的方法進行。大約9g的蜜蜂胸部組織勻漿于300 ml 0.1 M Tris-HCL緩沖液，pH 7.5，內含0.25 M蔗糖, 0.01 M NaCL, 和0.05 MEDTA。通過差速離心來收集線粒體，重懸于12 ml pH 8.0, 0.2 M Tris-HCL 緩沖液，內含0.1 M EDTA 和1% SDS。加蛋白酶K至終濃度為90 μg/ml，然后60℃孵育2hr，16000g離心10min，去上清，加2ml 5 M醋酸鉀 pH 6 ，冰上放置30min，12000g離心10min，上清經酚、氯仿多次抽提去蛋白，最后酒精沉淀線粒體DNA，溶于適量體積的TE緩沖液，－20℃保存?zhèn)溆谩?

1.2.2 引物設計和目標片段的PCR擴增

用于擴增中華蜜蜂COII和COIII的引物序列參照已經完成的意大利蜜蜂的線粒體基因組序列來進行(Genebank Acession：L06178)，在COII和COIII兩側分別設計特異性引物，其中用于擴增COII的引物序列為：F1：5’-ATG GCA GAA TAA GTG CAT -3’，R1：5’-CAA CTC TTA TAA TTC AGA CAT C-3’，用于擴增COIII的引物序列為：F2：5'-CAG CAA ATT TAA TTT CTG GAC-3'，R2:5'-GTA ATT GGA TTA AAT CCA CAT TC-3'。以蜜蜂的線粒體基因組DNA為模板PCR擴增出目的基因。PCR 擴增的條件為94 ℃變性3min，然后為94 ℃ 變性45 s, 54 ℃ 45 s,72 ℃60min, 共30個循環(huán)。RT -PCR 產物用2% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。低熔點凝膠回收分離目的片段, 與載體的連接、轉化, 酶切鑒定重組克隆。由上海生工基因公司測定DNA序列。

1.2.3 序列分析和用于比對的序列來源

測序的結果用GenBank/EMBL內的Blast軟件進行蜜蜂同源序列的搜尋和分析，利用CLUSTAL1.8進行序列的多重比對。進化分析利用PAUP (version 4.0 Beta)軟件進行，方法為最大簡約法。用于分析的序列來源為（GenBank的接入號）：Apis mellifera(11990602); Apis dorsata(11761415); Apis koschevnikovi haplotype 1—2 (11761411, 11761413); Apis cerana haplotype 1—8 (11761395, 11761397, 11761399, 11761401, 11761403, 11761405, 11761407, 11761409); Apis nuluensis(11761393)，我們自己的CoII測序結果名為Achz; COIII 來自Apis mellifera (L06178)。

2 結果

2.1 C0II 和 CoIII 基因的PCR 擴增及基因克隆

以中華蜜蜂的線粒體DNA為模板，設計的特異性引物順利擴增了編碼Ac-COII和Ac-COIII的線粒體DNA片段，大小分別為960bp和1300bp（圖1），與預期的大小相符。擴增的片段與PGEM－T eazy 載體連接，經酶切鑒定與PCR擴增的大小一致（圖2）。

圖 1 從線粒體基因組DNA PCR擴增的COII和COIII

圖 2 擴增的COII和COIII與T載體連接后的酶切鑒定

2.2 序列分析

PCR成功擴增了華蜜蜂的完整的COII序列（Ac－CoII）和COIII序列（Ac－CoIII）。其中編碼Ac-COII的序列全長為681bp，編碼一個226個氨基酸殘基的細胞色素氧化酶II單位（圖3），在核苷酸水平上，中華蜜蜂Ac-CoII序列較意大利蜜蜂的多三個核苷酸，一致性為90％。Ac-CoIII序列的長度為780bp，可編碼一長度為259個氨基酸殘基的蛋白，核苷酸水平的一致性為84％（圖4）。

一般生物體的線粒體DNA AT含量比較高。在中華蜜蜂的COII里含量為80.7％，而在意大利蜜蜂線粒體內是78.4％。兩者均低于意大利蜜蜂線粒體的平均AT％（83％）。在COIII基因內也有相同的趨勢，在中華蜜蜂和意大利蜜蜂體內分別為80％和83％。意大利蜜蜂COIII的AT％與線粒體的平均值相同。

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 圖 3 細胞色素氧化酶II單位的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

在所擴增的Ac－COII片段上游同時包含了tRNAleu和隨后的一小段非編碼序列，該段非編碼序列在中華蜜蜂體內是88bp，在意大利蜜蜂體內是201bp。Ac－CoII的下游序列則包含了tRNAArg的基因序列和隨后的6bp非編碼序列，其在意大利蜜蜂體內為7bp。

擴增的Ac-CoIII 序列上游包含部分的ATpase6基因和隨后的18bp的非編碼序列，該序列在意大利蜜蜂體內是21bp。Ac－CoIII的下游序列則包括一個56bp的非編碼區(qū)（在意大利蜜蜂體內為70bp）、tRNAGly基因和部分的NADH3基因。

兩種蜜蜂的COII在氨基酸水平上有95％的一致性，總計有12個氨基酸殘基不同。其中大多數(shù)不同的氨基酸殘基具有相似的化學性質，只有2個氨基酸殘基發(fā)生化學性質不同的替代，這種情況對于維系CoII的活性是非常重要的。利用軟件對兩種蜜蜂的CoII進行疏水性的分析表明兩者具有基本一致的疏水性特征。Ac－CoII比意大利的CoII在C末端多出一個氨基酸殘基，對酶的活性影響不大。

CoIII在兩種蜜蜂之間具有79％的一致性，有33個氨基酸殘基發(fā)生了變化，其保守性較CoII小許多。可能意味著COIII在功能上較COII的作用要小一些。

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圖 4 細胞色素氧化酶III單位的核苷酸序列和氨基酸序列

在GenBank內越來越多的核苷酸和蛋白序列使得我們有可能利用CoII序列的信息進行系統(tǒng)進化的分析。我們采用PAUP軟件的最大簡約法來對已知的蜜蜂CoII序列進行進化分析，結果見圖5。我們所測定的中華蜜蜂的CoII序列與其他已經獲得的CoII序列很好的落在同一個分支內，其他蜜蜂種類在不同的分支內，能夠反應蜜蜂的系統(tǒng)進化關系。

3 討論

克隆的這兩個基因所包含的非編碼區(qū)序列均比意大利蜜蜂的對于序列要小，而位于tRNAleu和COII基因之間的最大的非編碼區(qū)在東方蜜蜂的體內變異很大，有些地理種群同意大利蜜蜂的相差無幾，而另一些則可能完全缺失[10]。因此，從進化的角度上來說，中華蜜蜂更原始一些。

圖 5 基于COII的核苷酸序列對不同種類及倍型的蜜蜂進行的系統(tǒng)進化樹的分析結果

從兩個亞基的氨基酸序列分析來看，CoII發(fā)生改變的氨基酸殘基少一些，一致性更高一些，在改變的氨基酸殘基里大多是趨于相同性質的氨基酸殘基的，對于整個蛋白的結構和功能的影響不大。而CoIII則無論是在一致性、發(fā)生改變的氨基酸殘基的比例和性質均有較大的變化，因而在蛋白的結構和功能上的變化較CoII要大一些。這種情況表明CoII在進化的過程中更保守，擔負的生物功能更重要。相對來說CoIII的重要性要小一些。

蜜蜂的線粒體基因是母系遺傳的，在研究分析不同種類之間的系統(tǒng)進化關系時具有重要的意義。迄今為止，已有多種線粒體基因被用于系統(tǒng)進化關系的分析，包括NADH, 16sRNA, 28sRNA, COII, COI, ATPase 等等。隨著這方面資料的不斷的積累，可以利用基因的序列信息對它們的系統(tǒng)關系進行研究。本研究我們利用COII的核苷酸序列信息，對不同蜜蜂種類的系統(tǒng)關系進行研究，結果表明能夠明確的將各種類區(qū)別開來，即便是在東方蜜蜂的各不同亞種之間，也比較好的進行了分類。該序列信息是完全可以用于衡量物種系統(tǒng)關系的，具有一定的理論意義。

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福建農林大學蜂學學院 李江紅

浙江大學應用昆蟲研究所 張傳溪