蜂蜜中酚類化合物的分析研究進(jìn)展
蜂蜜用作食品的歷史非常悠久，但直到最近幾年才被證實(shí)具有抗氧化性。蜂蜜抗氧化性的強(qiáng)弱取決于蜜源、季節(jié)、環(huán)境因素，以及蜜蜂的釀蜜過程。據(jù)報(bào)道，蜂蜜中至少有181種物質(zhì)與傳統(tǒng)醫(yī)藥相關(guān)。蜂蜜中主要的抗氧化成分包括類黃酮和酚酸、酶類(葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶)、抗壞血酸、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、類胡蘿L素物質(zhì)、有機(jī)酸、氨基酸和蛋白質(zhì)等。這些天然的抗氧化劑，尤其是類黃酮類物質(zhì)，具有抗菌、消炎、抗過敏、抗血栓形成和血管擴(kuò)張等廣泛的生物學(xué)活性。
蜂蜜的品質(zhì)是由蜜源種類及其化學(xué)組成決定的，蜜源種類可通過分析蜂蜜中的花粉來識(shí)別。研究發(fā)現(xiàn)，用化學(xué)的方法有可能更加準(zhǔn)確地識(shí)別蜂蜜的來源，這其中就包括了對(duì)類黃酮中有關(guān)酚類化合物的分析。例如：黃烷酮橘皮素已經(jīng)用作柑橘屬蜜的標(biāo)記性成分，黃烷酮堪非醇用作蜜迷迭香蜜的標(biāo)記成分，橡黃素用作向日葵蜜的標(biāo)記成分。因此，對(duì)蜂蜜中酚類化合物的分析研究不僅有利于提高人們對(duì)蜂蜜抗氧化性的認(rèn)識(shí)，而且對(duì)蜜源植物及其地理起源也有重要意義。
酚類是指苯及其稠環(huán)的經(jīng)基衍生物。根據(jù)所含經(jīng)基數(shù)目可分為一元、二元和多元酚。酚類化合物廣泛分布于植物體中，至今已發(fā)現(xiàn)8000多個(gè)不同的結(jié)構(gòu)。這些化合物具有防癌、消炎、防止動(dòng)脈粥樣硬化及血栓形成、免疫調(diào)節(jié)和止痛等作用。根據(jù)酚類化合物的基本結(jié)構(gòu)至少可分成10類：簡(jiǎn)單的酚、酚酸、香豆素和異香豆素、萘酮、氧雜蒽酮、芪、蒽醌、類黃酮和木質(zhì)素。其中，類黃酮是最重要的多酚類，擁有超過5000種已知結(jié)構(gòu)的化合物。
一般來說，酚類化合物的分析程序包含三個(gè)基本步驟：提取、分離和定量。分析方法包括：比色反應(yīng)、薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)和毛細(xì)管電泳法(CE)。
1 樣品制備
從樣品中分離出酚類化合物是分析測(cè)試的先決條件。通常采用固相提取法，包括以下幾個(gè)步驟：1份蜂蜜樣品加5份水混合(用HCI調(diào)節(jié)pH為2)，分離固體粒子；用離子交換樹脂XAD-2過濾，酚類化合物仍然留在交換器內(nèi)而糖和其他極性化合物被洗提，這使得類黃酮的收回率高于95％；交換器用酸(用HCl調(diào)pH為2)洗滌后再用蒸餾水洗。所有的酚用甲醇洗提；40℃減壓條件下干燥。由于濾液中混有交換樹脂，所以對(duì)提取物還要做一個(gè)修正，在裝入前還需用磁力攪拌器攪拌10 min。
用以下兩種不同的方法進(jìn)行下一步的提純：①甲醇蒸發(fā)后獲得了懸浮在蒸餾水中的殘余物，用二乙醚萃取。醚的提取物是結(jié)合狀態(tài)的，二乙醚可用氮沖洗，干的剩余物再用甲醇溶解過濾。②剩余物用甲醇溶解，溶液通過葡聚糖凝膠LH-20柱。酚在減壓狀態(tài)下濃縮干燥，然后再用甲醇溶解過濾。
2 分光光度測(cè)定法
以Folin-Ciocalteu(弗林)試劑反應(yīng)為基礎(chǔ)的分光光度法是測(cè)定蜂蜜中總酚的一種廣泛使用的方法，包括以純的酚類化合物做標(biāo)準(zhǔn)，從樣品中提取酚，顏色反應(yīng)后測(cè)定其吸光度。比色測(cè)定的主要缺點(diǎn)在于它的特異性低，任何可氧化酚的羥基都會(huì)導(dǎo)致顏色反應(yīng)的發(fā)生。
Folin-Ciocalteu法通常采用的步驟：蜂蜜樣品經(jīng)蒸餾水稀釋并過濾，然后與Folin-Ciocalteu試劑混合5 min，并添加碳酸鈉。經(jīng)溫室培養(yǎng)后，在760 nm處測(cè)定其吸光度，以甲醇作空白對(duì)照，用沒食子酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定3次。酚類化合物的含量以每毫克沒食子酸的量等價(jià)100 g蜂蜜來表示。
3 色譜測(cè)定法
高效液相色譜法(HPLC)無疑是最育用的分析多酚化合物的技術(shù)。氣相色譜(GC)法開始時(shí)用于多酚化合物的鑒定。氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)法也用于蜂蜜中的類黃酮分析。
使用最廣泛的HPIJC方式是反相HPLC。在這種情況下，固相由一個(gè)非極性的C18連接，流動(dòng)相是一極性溶劑。
HPLC方法分離蜂蜜中的酚類化合物采用的分離柱有：XTerra RPl8(15 cm×0.39 cm，5 μm)，Lichrocart RP-18 (10，12.5，18.1 cm×0.4 cm，5 μm)，C18(15 cm×0.46 cm，5 μm)，Discovery RP Amide C16(15 cm×0.46 cm，5 μm)。流動(dòng)相有：A.水：蟻酸(99.5：0.5，95：5；19：1，v／v)；B.甲醇。探測(cè)DAD的波長(zhǎng)分別為：90 nm，270nm，285nm，340nm。
提取系統(tǒng)：SPE(離子交換樹脂XAD-2)，二乙醚萃取，葡聚糖凝膠LH-20。用HPLC法分離鑒定出的化合物有：p-羥基酸、香草酸、丁香酸、P-羥苯基丙烯酸、肉桂酸、短葉松素、櫟精、莰非醇、5，7-二羥基黃酮、高良姜精、鞣酸、楊梅酮、查耳酮、糖苷、毛地黃黃酮、8-甲氧堪非醇、5，4，二羥-7-甲氧基黃酮、柚木柯因、楊梅酮、茨非醇、二甲醚、8-甲醚、3-甲醚、8-甲氧基咖啡酸、順反脫落酸、反反脫落酸、柯因、桔皮素、櫟精糖苷、咖啡酸、苯乙烯酸、鎵酸、綠原酸、p-香豆酸、O-香豆酸、阿魏酸、五羥黃酮、櫟皮酮、苯甲酸、肉桂酸、3-甲基櫟皮酮、尿黑酸等。
在色譜測(cè)試中，使用最多的波長(zhǎng)是290 nm和340 nm。由于一些酚類化合物表現(xiàn)出多個(gè)吸收最高值，因而推薦使用同步復(fù)合紫外光(光電二極管排列)來識(shí)別，同時(shí)這種探測(cè)器還提供伴隨有任何波長(zhǎng)洗提帶的吸收光譜層析圖。用這種方法，吸收譜能與保存參數(shù)結(jié)合來鑒定未知的物質(zhì)，同時(shí)還可測(cè)定洗提帶的純度。
NMR光譜測(cè)定法常被作為測(cè)定多酚結(jié)構(gòu)的補(bǔ)充技術(shù)使用。
4 電泳測(cè)定法
毛細(xì)管電泳(CE)法和HPLC法常被用作分析蜂蜜中酚類化合物的方法。毛細(xì)管電泳法具有分析次數(shù)少和分離效率高的優(yōu)點(diǎn)。快速、簡(jiǎn)便、高分辨率和低操作成本使得這一技術(shù)在改進(jìn)鑒定蜂蜜酚類化合物技術(shù)方面極具吸引力。
毛細(xì)管電泳法分析蜂蜜樣品和酚類化合物的最優(yōu)條件(毛細(xì)管的有效長(zhǎng)度、毛細(xì)管的內(nèi)部直徑、檢測(cè)的波長(zhǎng)、電壓、溫度、注射時(shí)間、緩沖液濃度)見表1。
5 小結(jié)
蜂蜜的質(zhì)量取決于它們的化學(xué)成分和植物來源，而多酚化合物的含量受到植物來源、地理來源和氣候特征的影響，因而鑒定和量化蜂蜜中的多酚化合物意義重大。此外，蜂蜜中的多酚如類黃酮和酚酸等具有很強(qiáng)的抗氧化活性，這一特性對(duì)人類的健康有益。近年來，通過多種現(xiàn)代分析技術(shù)，如GC，HPlC，CE法，并結(jié)合二極管探測(cè)和光譜測(cè)定，對(duì)蜂蜜中多酚化合物的種類、含量、結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了越來越深入的研究，為蜂蜜中多酚化合物的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)（略）
引自《蜜蜂雜志》2007（1）
此為