摘要：從結(jié)構(gòu)、藥理作用、基因工程及分子生物學(xué)機制等方面總結(jié)7國內(nèi)外對蜂毒肽的研究概況，以期為相關(guān)研究提供有益參考。

關(guān)鍵詞：蜂毒膚；結(jié)構(gòu)；藥理作用；基因工程；分子生物學(xué)機制

蜂毒是工蜂毒腺分泌出來的一種具有芳香氣味的成分復(fù)雜的混合物，主要含有蛋白質(zhì)多肽類、酶類、生物胺類和其他物質(zhì)。蜂毒中研究較多的是蜂毒溶血肽，又稱蜂毒肽(melittin)。蜂毒肽占蜂毒干重的50％，是蜂毒中主要功能物質(zhì)。蜂毒肽可以抗菌、抗病毒、消炎、抗輻射，近年來又有對其抗癌作用進行研究的報道。但是其臨床應(yīng)用卻有很多局限，主要原因是現(xiàn)有技術(shù)難以將蜂毒中有致敏反應(yīng)并與蜂毒肽分子量接近的磷脂酶A2完全去除。基因工程的出現(xiàn)不失為一條有效途徑。現(xiàn)將近年來國內(nèi)外的研究進展作以下綜述，以期為今后的研究提供參考。

1 蜂毒肽的結(jié)構(gòu)

蜂毒肽是由26個氨基酸殘基組成的多肽，分子量2840，其一級結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基順序為NH2-GLY-ILE-GLY-ALA-VAL-LEU-LYS-VAL-LEU-THR-THR-GLY-LEU-PRO- ALA-LEU-ILE-SER-TRP-ILE-LYS-ARG-LYS-ARG-GLN-GLN-COOH。

在通常情況下，C-末端有4個氨基酸殘基攜帶正電荷，N-末端有2個氨基酸殘基攜帶正電荷，整個分子帶6個正電荷。蜂毒肽的N-末端起前20個氨基酸殘基主要是疏水的，C-末端的6個氨基酸殘基主要是親水的。分子的3個賴氨酸和2個精氨酸殘基使其成為強堿性肽。在個性水溶液中，蜂毒肽作為單體是以隨機的卷曲結(jié)構(gòu)存在的，而隨著pH值以及離子強度的增高，蜂毒肽自我交聯(lián)，形成螺旋的四聚體結(jié)構(gòu)。最近有研究發(fā)現(xiàn)在不同的溶液中蜂毒肽的螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域及螺旋間的角度是不同的。螺旋結(jié)構(gòu)中前21個氨基酸是極性的，位于螺旋的表面，而非極性氨基酸在螺旋的另一面。這個兩親性(amphiphilie)是膜結(jié)合肽和膜蛋白跨膜螺旋的特征。所以這個特性決定蜂毒肽既可以溶于水中，又可以與膜自然結(jié)合，進而溶解細胞。

2 蜂毒肽的藥理作用

蜂毒肽是迄今為止人類所知的抗炎活性最強的物質(zhì)之一，其抗炎活性是氫化可的松的100倍，可以抑制20多種革蘭氏陰性和陽性細菌的生長繁殖，尤其是蜂毒肽可以抗對青霉素具有耐藥性的金黃色葡萄球菌。蜂毒肽還能增強磺胺類和青霉素類藥物的抗菌效力，對多種真菌、病毒也具有毒性。它具有類激素樣的作用，但無激素的不良反應(yīng)。蜂毒肽的鎮(zhèn)痛作用也十分顯著，其對前列腺素合成酶的抑制作用是吲哚鎂辛的70倍，鎮(zhèn)痛強度為嗎啡的40％，鎮(zhèn)痛持續(xù)時間較長。實驗研究證明，全蜂毒、蜂毒肽、神經(jīng)毒多肽、MCD均能刺激垂體腎上腺系統(tǒng)使皮質(zhì)激素釋放增加而產(chǎn)生抗炎作用。蜂毒肽還能抑制白細胞轉(zhuǎn)移，從而抑制了局部的炎癥反應(yīng)。

蜂毒肽可以作用于神經(jīng)系統(tǒng)，其對N-膽堿受體有選擇性阻滯作用，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮傳導(dǎo)阻滯，并表現(xiàn)出中樞性煙堿型膽堿受體阻滯作用；蜂毒肽還能抑制周圍神經(jīng)沖動傳導(dǎo)。

用蜂毒肽代替蜂毒全毒不僅對輻射有預(yù)防作用，而且還有治療作用。高純度的蜂毒肽可以明顯提高抗輻射效應(yīng)，而且和全蜂毒比較差別非常明顯。蜂毒肽對腫瘤細胞的毒性作用也引起了人們的注意。蜂毒肽具有膜活性，直接對細胞的磷脂膜起溶解作用，抑制細胞發(fā)育，對腫瘤細胞有強烈的細胞毒素作用。蜂毒肽分子量小，免疫原性低，不易產(chǎn)生過敏反應(yīng)；因其是破壞細胞膜而導(dǎo)致細胞的死亡，因此它不用進入細胞，在細胞外即可顯示出其破壞腫瘤細胞毒性。澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織(CSIRo)DE Riven博士領(lǐng)導(dǎo)的分子生物學(xué)研究小組正在對蜂毒肽的抗癌作用進行研究，他們制造的以蜂毒肽為“彈頭”的抗毒素也可對前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌產(chǎn)生療效。《中國醫(yī)藥報》也曾報道，蜂毒素可抑制肝癌細胞的生長、增殖，并且減少增殖細胞中和抗原附性細胞的表達，影響細胞周期的比率，為蜂毒素臨床應(yīng)用于抗腫瘤提供了實驗依據(jù)。

3 蜂毒肽的基因工程

生物工程技術(shù)的發(fā)展為獲得蜂毒肽提供了一條新的途徑，Kindas等從******蜂王的毒腺中提取得到了總mRNA，發(fā)現(xiàn)蜂毒肽mRNA含大約400個堿基對和1個短的poly A尾。Vlasak等用mRNA-DNA逆轉(zhuǎn)錄的方法，利用質(zhì)粒pBR322構(gòu)建了蜂王毒腺的cDNA文庫，用蜂王毒腺總mRNA制作探針從此文庫中分離得到了蜂毒肽的cDNA，再進一步將其克隆到質(zhì)粒pUC18上進行DNA序列分析，由DNA的序列分析結(jié)果推測出的蜂毒肽序列與實際測得的完全相同。張青文從1991年開始提取了蜂王毒腺的RNA，用于棉鈴蟲卵中的轉(zhuǎn)譯，成功地合成了Promelittin，并對提取的mRNA成分進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總RNA在除去rRNA后就可得到高純度的蜂毒肽mRNA。李繼周等于1997年通過mRNA-cDNA反轉(zhuǎn)錄的方法合成了蜂毒肽基因，用lgtll 建立了蜂毒肽的cDNA文庫，并用抗體探針篩選出了附性克隆。陳仲兵等進一步將蜂毒肽cDNA克隆到大腸桿菌質(zhì)粒Pucl8上，并進行了序列分析。王關(guān)林等從蜜蜂毒腺中提取總RNA，通過RT-PCR方法擴增得到了蜂毒肽前體蛋白的cDNA，再進一步通過定點誘變在蜂毒肽序列前引入了經(jīng)胺裂解位點，構(gòu)建了與β-半乳糖昔酶部分序列相融合的蜂毒肽誘變蛋白表達載體，序列分析結(jié)果表明，成功地引入了目的密碼子，且與β-半乳糖苷酶部分序列構(gòu)成正確的讀碼框，并在大腸桿菌中表達了誘變蛋白。王關(guān)林克隆了蜂毒肽前體蛋白的cDNA，并在大腸桿菌中表達了與β-半乳糖苷酶部分序列相融合的蜂毒肽前體蛋白。王秋波等報道通過人工合成含特異性酶切位點的AB兩條寡核苦酸片段，在Klenow 酶作用下形成目的基因，用限制型內(nèi)切酶Hind Ⅲ，Xmn Ⅰ同時酶切目的基因和表達載體Pmalp2質(zhì)粒，在T4連接酶的作用下構(gòu)建兩者的重組體，通過α-互補篩選出附性克隆，并通過特異性酶切和測序分析進行鑒定，獲得重組蜂毒肽的原核表達克隆。

蜂毒肽的溶血作用限制了它的臨床應(yīng)用。為克服其溶血毒副作用，人們嘗試通過改變蜂毒素分子構(gòu)像，將蜂毒素分子與腫瘤特異性抗體偶聯(lián)成免疫毒素或制成緩釋劑等方法來減輕其不良反應(yīng)，增強抗腫瘤活性的目的。

趙亞華等為獲得保留有抗菌活性而降低溶血作用的蜂毒素，對蜂毒素的分子結(jié)構(gòu)進行了改造。將第5位的Val變?yōu)锳rg，第15位Ala變?yōu)锳rg，刪除了第16位的Leu。用PCR技術(shù)獲得了改造后的蜂毒素基因，將其克隆人酵母表達載體pPICZa-A，獲得重組表達質(zhì)粒PPICZa-A-MEA。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS115，甲醇誘導(dǎo)下表達，發(fā)酵上清液經(jīng)抑菌活性、溶血活性測定及親和層析純化，結(jié)果表明，蜂毒素基因成功地在畢赤酵母中表達，經(jīng)改造后表達的蜂毒素保留了抗菌活性且溶血活性顯著降低，經(jīng)純化后用Bradford法測定表達蜂毒素的含量約為0.29 mg/mL。

李柏、張晨等應(yīng)用基因工程，構(gòu)建攜蜂毒素基因及甲胎蛋白(AFP)啟動子(rAFP)的重組腺病毒載體，探討rAFP驅(qū)動的蜂毒素基因在體外對肝癌細胞的特異性殺傷作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：攜蜂毒素基因重組腺病毒載體構(gòu)建成功，MTr實驗證明攜蜂毒素基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染后，AFP附性肝癌細胞的增殖受到明顯抑制，而對AFP陰性肝癌細胞及正常肝細胞無明顯影響；無蜂毒素基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染，則對各種細胞增殖均無抑制作用，他們等還發(fā)現(xiàn)蜂毒素基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染BEL-7402細胞后，肝癌細胞周期受到不同程度的影響，Go/G期細胞增多，細胞增殖核抗原(PCNA)標(biāo)記指數(shù)較對照組明顯下降，提示癌細胞較多被阻滯于G期，蜂毒素基因在癌細胞內(nèi)的表達干擾了其細胞周期，抑制了癌細胞的增殖，而抑制PCNA的合成可能是其作用機制之一。細胞增殖與凋亡的失衡決定了腫瘤的生長速率。凋亡不僅直接影響著機體組織的正常發(fā)育、分化與死亡，它在腫瘤治療中的作用已受到極大的重視。研究證明，蜂毒素具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。經(jīng)攜蜂毒素基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染后，倒置相差顯微鏡下觀察到部分肝癌細胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)變化，體積變小、變圓，染色質(zhì)邊集等現(xiàn)象。攜蜂毒素基因重組腺病毒可有效誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，凋亡率在20％左右，高于不舍蜂毒素基因重組腺病毒和未轉(zhuǎn)染重組腺病毒對照組，提示誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡亦是蜂毒素基因治療發(fā)揮作用的機制之一。

4 蜂毒肽的分子生物學(xué)機制

至今為止，對于蜂毒素的殺菌及溶血機理仍然很不確定，以往研究認為，抗細菌素類是通過穿孔模型形成膜空洞機制引起殺菌的。但深入研究發(fā)現(xiàn)，有些抗細菌素與細胞膜的作用方式與穿孔模型有明顯不同，后來便提出了一種新的作用模式--地毯模式。

目前，抗細菌素侵膜機理占主導(dǎo)地位的觀點仍然是穿孔模型和地毯模式機理。根據(jù)蜂毒素的這種侵膜機制，趙亞華等通過實驗有目的地改造了蜂毒素的氨基酸的一級結(jié)構(gòu)序列以及所要表達的蜂毒素基因。盡量使蜂毒素在與細菌細腦膜相互作用時，主要采取地毯模式侵膜而引起殺菌，同時，由于帶電荷數(shù)與分子構(gòu)象的改變，大大降低了它與血細胞膜兩親性作用的幾率，從而達到抑制溶血性的目的。改造后的蜂毒素的溶血性與標(biāo)準(zhǔn)樣品的溶血活性相比，有較大幅度降低，大約降低了14.3倍。

蜂毒肽發(fā)揮其眾多功能的主要機理是因為蜂毒肽可以使細腦膜的透性增加，細胞內(nèi)容物泄露，細胞裂解所以蜂毒肽與天然或是模型膜的作用成為蜂毒肽研究的熱點。Benachir等利用鈣黃綠素作為熒光標(biāo)記物，系統(tǒng)研究了蜂毒肽誘導(dǎo)的膜滲漏。他們認為蜂毒肽與囊泡的結(jié)合會非常迅速，因為在蜂毒肽作用幾分鐘之后，內(nèi)容物的流出達到最大值，并且停止；而且蜂毒肽誘導(dǎo)的磷脂雙分子層的裂解的發(fā)生機制是“全或無”，也就是說蜂毒肽作用下，有的囊泡的內(nèi)容物全部釋放，而有的則保持完整，沒有滲漏，這與Schwarz 等觀察的一致。內(nèi)容物釋放的比例與蜂毒肽/脂質(zhì)的摩爾比率有關(guān)，只有達到一定量的蜂毒肽才可能有內(nèi)容物滲出。更為特別的是蜂毒肽可以區(qū)別出完整的和已經(jīng)有物質(zhì)滲出的囊泡，說明這兩類脂質(zhì)雙分子層的性質(zhì)有很大的不同。最近有很多報道認為，微粒表面的負電荷可以抑制蜂毒肽對細胞的裂解作用，Benachir等的工作表明卵磷脂雙分子層表面負電荷的存在對蜂毒肽的裂解能力有抑制作用，并且與負電荷的密度成一定比例。這可能是由于靜電作用吸附蜂毒肽，而不能更加深入破壞囊泡而形成滲漏。

蜂毒肽可以作用多種酶及細胞蛋白，在裂解的細胞中蜂毒肽能結(jié)合或改變幾種蛋白質(zhì)功能。如蜂毒肽可以抑制蛋白激酶C；與鈣調(diào)蛋白(calmodulin)具有高度親極性。Fukushi-ma實驗中觀察到蜂毒肽抑制小鼠大腦皮質(zhì)的突觸膜上依賴鳥苷酸的腺苷酸環(huán)化酶活性；還發(fā)現(xiàn)蜂毒肽能明顯刺激Gil和Gll活性，但卻抑制Gs活性。動力學(xué)研究表明蜂毒肽抑制Gs活性是因為抑制GDP的釋放，從而增加了鳥苷酸造成的。而激活Gi與抑制Gs很可能與抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性有關(guān)。細胞脂酶的活性產(chǎn)物包括三磷酸肌醇(IP3)、甘油二酯(DG)和脂肪酸(FA)等是細胞生理活動重要的第二信使系統(tǒng)，而有實驗表明蜂毒肽可以激活細胞脂酶，包括磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、磷脂酶Az(PLAJ及甘油三酯酶等。磷脂和甘油三酯是細胞內(nèi)主要的酰化酯(包含脂肪酸)。而甘油三酯的相對含量可占細胞總脂量的5％～60％。

5 總結(jié)

蜂毒肽由于其具有抗炎、殺菌、抗腫瘤等作用，已在醫(yī)療上得到廣泛應(yīng)用，但由于其來源有限，成本過高，且有直接溶血作用，應(yīng)用受到嚴重制約。目前還尚未有完善的方法技術(shù)來大量生產(chǎn)蜂毒肽。從理論上講，由于蜂毒肽對生物膜的破壞作用，克隆得到的蜂毒肽cDNA如果直接在原核或真核表達系統(tǒng)中表達對細胞具有致死性，因而現(xiàn)在很多學(xué)者都試圖通過利用基因工程來改造蜂毒肽的分子結(jié)構(gòu)或構(gòu)象，或是將其融合到其他細胞基因中，或者表達其前體蛋白，然后經(jīng)過適當(dāng)修飾處理獲得對正常細胞毒性較小的蜂毒肽。近年來，通過基因工程獲得蜂毒肽的方法已經(jīng)取得一定進展，但仍有許多不足之處，距離大規(guī)模生產(chǎn)還有很長的一段路。如何進一步提高基因表達水平，提高基因表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性等，是今后值得深入研究的問題。

引自《蜜蜂雜志》2007（5）